B - Bactéries aérobies , bactéries anaérobies
 

Les bactéries aérobies tirent leur énergie, comme les eucaryotes, de la glycolyse suivie du cycle de Krebs (voir cours de bioénergétique).

Les bactéries anaérobies tirent leur énergie de la fermentation du glucose ou d'autres substrats organiques (alcool éthylique, lactose, arabinose, sorbitol). Le tableau ci-contre résume les principaux types de fermentations bactériennes.

Il faut noter que certaines bactéries sont aéro-anaérobies. Selon le milieu dans lequel elles se trouvent, elles peuvent vivre grâce au métabolisme respiratoire (aérobie) ou fermentaire (anaérobie).

Une façon agréable d'aborder le métabolisme fermentaire chez les bactéries est l'étude de la fabrication d'un Yaourt (voir annexes) qui met en jeu la fermentation lactique.

La méthanisation de certains déchets urbains (boues d'épuration, ordures ménagères ) permet de récupérer de l'énergie sous forme de biogaz (méthane).

Principales fermentations
Type defermentation
Principaux microorganismes responsables
Substrat fermentescible usuel
Produits principaux de la fermentation

Alcoolique

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces ellipsoïdeus

Kleickeria apiculata

Glucose

Alcool éthylique

Lactique

Streptococcus sp.

Lactobacrterium sp.

Thermobacterium bulgaricum

Glucose

Acide lactique

Butyrique (acétonique)

Clostridium butyricum

Butyribacterium sp.

Bacillus sp.

Glucose

Acide burytique

(acétone)

Propionique

Propionobacterium sp.

Vallionella sp.

Glucose

Acide propionique

Acétique

Bacterium aceti

Bacterium acetosum

Bacterium oxydans

Alcool éthylique

Acide acétique

Fermentations intestinales

Escherichia coli

Acetobacter sp.

Salmonella sp.

Glucose, lactose,

arabinose, sorbitol

Acides formique,

Acétique, lactique,

Succinique : alcool

Ethylique, CO2,

H2,3-2-butylène glycolÖ

Méthanique

 

Ose

Méthane

III - Techniques d'étude des bactéries
 

Quelles que soient les études bactériologiques réalisées dans des laboratoires de recherche fondamentale ou des laboratoires de microbiologie appliquée, les techniques générales et les matériaux fondamentaux utilisés sont toujours les mêmes.

 

A- Une règle indispensable : travailler en milieu stérile

 

Cette règle assure la fiabilité des manipulations et la sécurité du travail (attention le danger microbien est " invisible ").

 

1 - Généralités

 

Les bactéries sont présentes dans tous les milieux, or le bactériologiste travaille dans l'atmosphère du laboratoire ; il doit donc préserver toutes les manipulations qu'il réalise de la contamination bactérienne. Il doit travailler en milieu stérile.

* milieux de cultures stériles, matériel stérile.

* prélèvement des germes à étudier ou à rechercher, en milieu stérile.

* manipulations bactériologiques en milieu stérile.

 

La moindre contamination par les germes atmosphériques ou apportée par les instruments entraîne des résultats faux et aberrants.

 

 

2 - l'appareillage de stérilisation indispensable

 

Pour effectuer ces stérilisations, il existe plusieurs moyens :

* la chaleur,

* la filtration,

* les agents chimiques,

* les radiations.

 

 

a) la chaleur

 

La stérilisation par la chaleur sèche est très utilisée pour le matériel sec. Elle est réalisée grâce à des étuves à haute température.

 

On considère qu'un chauffage à 170° pendant 30mm permet une stérilisation complète.

Lorsque l'on manipule des souches bactériennes (ensemencement, repiquage) il faut travailler près de la flamme d'un bec BUNSEN.

La stérilisation par la chaleur humide est d'emploi plus général. Elle convient aux récipients mais aussi pour les solutions et les milieux nutritifs. On utilise un autoclave qui permet d'atteindre des températures de 120°C à une pression de plusieurs bars qui détruisent les spores les plus résistantes.

 

On considère qu'un chauffage à 120°C à 3 bars pendant 10 mm permet une stérilisation complète.

 

 

 

b) La filtration

 

 

Le but est de faire passer le liquide à stériliser à travers un disque de verre ou une membrane filtrante stérile. (La récupération se fait dans un " erlenmeyer " bien entendu stérile).

 

c)Les agents chimiques

Ils sont nombreux citons :

* les halogènes (Hypochlorite de Sodium, Chlore, Brome),

* les alcools aliphatiques,

* les aldéhydes (formaldéhyde ou formol),

* les phénols,

* l'hexachlorophène,

* détergents cationiques, etc...

Toutes ces substances sont bactéricides c'est-à-dire qu'elles tuent les bactéries.

 

d) Les radiations

 

Ce sont les ultra violets qui sont les plus bactéricides à 2537 . On arrive à tuer 90 % d'une population bactérienne lorsque le champ appliqué est de 15000 ergs/cm2.

 

B - Milieux de cultures utilisés

1- Généralités
 

Les micro-organismes exigent pour leur croissance des aliments ; ces aliments leur sont fournis au laboratoire par des milieux nutritifs ou milieux de culture.

Pour permettre des microbes le milieu doit :

*contenir tous les aliments nécessaires en quantité suffisante et en proportion relative convenable : le milieu doit être nutritif et équilibré.

* avoir un pH, une pression osmotique, une viscositéÖ en un mot, des caractéristiques physico-chimiques compatibles avec la vie microbienne.

 

Comme les besoins nutritionnels des micro-organismes et les conditions de leurs développements sont très variés il n'existe évidemment aucun milieu universel sur lequel tous les microbes soient capables de se multiplier. Toutefois, certains milieux conviennent au développement d'une grande variété de germes microbiens ; le choix de tels milieux repose sur la connaissance de l'habitat naturel et de la physiologie alimentaire du groupe de germes que l'on désire cultiver.

Dans ces conditions l'on conçoit que les milieux de culture soient nombreux et variés. d'une manière très générale, on peut distinguer :

* les milieux naturels : lait, pomme de terre, moûts sucrésÖ

* les milieux artificiels : à base d'extrait de viande ou d'extraits végétaux auxquels sont ajoutés peptones, sucres, sels minérauxÖ

* les milieux synthétiques préparés exclusivement avec des produits chimiques purs.

 Le milieu synthétique de composition bien définie et toujours semblable à lui-même constitue le milieu de culture idéal. Ce type de milieu permet d'obtenir des résultats comparables et de déceler avec précision les modifications qu'il subit au cours du développement microbien. Il n'en est généralement pas de même avec les milieux non synthétiques qui sont constitués par des éléments complexes de composition variable. Malheureusement les milieux synthétiques conviennent surtout aux moisissures (champignons microscopiques) mais fort peu aux bactéries. Cependant pour ces dernières l'on dispose actuellement de milieux artificiels déshydratés, préparés industriellement, présentant une composition quasi-constante.

Qu'ils soient naturels, artificiels ou synthétiques les milieux peuvent être liquides (lait, bouillon de viande.) ou solides. Les milieux solides sont soit des milieux naturellement solides (pomme de terre, carottes) soit des milieux liquides solidifiés par addition de substances gélifiantes : gélatine, gélose.

Les milieux gélatinés ne demeurent solides qu'au dessous de 23-25° ; ils se liquéfient aux températures supérieures. En outre la gélatine, substance azotée et nutritive, est dégradée et liquéfiée par les germes protéolytiques.

Par contre la gélose, ou agar-agar, extraite d'une algue marine, est une substance hydrocarbonée non nutritive : elle ne constitue qu'un support du milieu de culture. Capable d'absorber 200 à 250 fois son poids d'eau, la gélose forme une gelée qui se liquéfie à 65-70° : en refroidissant, cette gelée demeure en surfusion jusqu'à 40-45° et prend une masse aux températures inférieures. La gélose est généralement incorporée aux milieux liquides à la dose de 15 à 20 â.

Les milieux solides, et en particulier les milieux gélosés, présentent un grand intérêt en Microbiologie. Ils permettent, lorsque la technique d'ensemencement est convenable, le développement des germes en colonies apparentes, isolées les unes des autres, provenant en principe, de la multiplication d'un seul germe (clone) et à partir desquelles peuvent être obtenues des cultures pures.

 

2 - Les milieux sélectifs

En partant d'un produit dont la population bactérienne est dense et hétérogène, l'isolement d'un germe donné sur milieux gélosés usuels n'est pas toujours possible. Dans ce cas l'on est amené à utiliser un milieu de culture sélectif, milieu sur lequel le germe ou le groupe de germes à étudier se développent alors que tous les autres micro-organismes présents sont inhibés . Un milieu de culture est rendu sélectif pour une espèce microbienne lorsque sont seules satisfaites les exigences nutritives et les conditions de développement particulières à cette espèce. Les principaux facteurs de sélection microbienne, utilisés seuls ou en association sont :

* la température d'incubation

* le pH du milieu

* la faculté d'utiliser une source nutritive déterminée (carbone, azoteÖ)

* la résistance à l'action bactéricide d'un antiseptique ou d'un antibiotiqueÖ

 

C - l'ensemencement des bactéries

 

l'ensemencement c'est mettre en culture un germe dans un milieu nutritif.

 

1 - Règles fondamentales

 

* l'ensemencement doit être pratiqué sur des milieux stériles avec des instruments stériles près de la flamme d'un bec BUNSEN.

* l'ensemencement ne doit en rien modifier la semence (bactérie), ni la contaminer, ni la stériliser.

 

Le matériel est constitué, entre autre de :

* Un fil à ensemencer ou Öse (Pl I, Fig. 1)

Fil en métal inoxydable maintenu à l'extrémité d'une tige métallique par un mandrin. Ce fil était autrefois en platine d'où le nom de " fil de platine " encore utilisé. On distingue le fil droit, l'anse et la spatule : fil droit pour ensemencement en piqure, la spatule pour l'ensemencement de cultures sèches, l'anse dans la plupart des autres cas.

* Une pipette Pasteur (I Fig.2 Pl ) 

La confection des pipettes Pasteur se fait à partir de tubes de verre d'environ 25-30cm de longueur et de 7/10 de diamètre, bouchés au coton aux deux extrémités et stérilisés au four. Utilisées dans le cas d'un inoculum liquide.

* Une pipette graduée,

* un étaloir (Fig. 3) Pl I,

* des tubes à essais milieu nutritif liquide ou solide gélosé droit ou incliné) (Fig.4) Pl I,

* Une boîte de Pétri (Fig.5) Pl I.

 

2 - Techniques d'ensemencement

 

1

 

 

2

3

4

Une boîte de PETRI s'incube à l'envers

 

5 vue de dessus

  • en coupe
  • a) Opérations préliminaires
     

    * Réunir tout le matériel nécessaire et le disposer sur la paillasse de façon rationnelle.

    * Etiqueter les tubes à ensemencer (nom de la culture, date de l'ensemencement, nature du milieuÖ)

    * Retrousser ses manches

    * Se laver les mains et les passer à l'alcool

    * Sortir à moitié environ les bouchons de coton (de façon à pouvoir les enlever rapidement par la suite).

     

    b) Ensemencement

     

    * Précautions générales :

    - Avant chaque prélèvement, flamber le fil ou la pipette et les laisser refroidir, extrémité ou pointe en bas.

    - Flamber l'orifice du récipient débouché avant et après chaque prélèvement ou ensemencement. Pendant ce flambage garder le bouchon de coton dans la main, entre le petit doigt et la paume ; ne jamais le poser sur la paillasse.

    - Après flambage, reboucher immédiatement

    - Opérer rapidement et toujours à proximité de la flamme du bec BUNSEN pour restreindre les possibilités de contamination.

    - Ne jamais poser le fil sur la paillasse sans l'avoir soigneusement flambé

    - Après leur dernière utilisation, placer les pipettes dans un récipient contenant une solution antiseptique puis stériliser avant de jeter.

     

    * Mode opératoire :

     

    a) Semence liquide portée en milieu liquide

     

    * Passer la pipette 3 ou 4 fois rapidement dans la flamme du Bunsen ; la laisser refroidir un instant, la partie effilée dirigée vers le bas.

    * Saisir le flacon contenant le produit à ensemencer, l'agiter correctement, le déboucher.

    * Flamber rapidement l'orifice du flacon

    * Plonger la pipette refroidie de 1 à 2 cm au plus dans le liquide sans toucher aux parois du flacon ; homogénéiser par aspirations et refoulements successifs.

    * Retirer la pipette ; flamber et reboucher le flacon

    * Prendre un tube en milieu, en flamber l'orifice, y introduire la pipette, laisser l'inoculum s'écouler librement, la pointe de la pipêtte reposant sur la paroi intérieure du tube au-dessus de la surface libre du liquide.

    * Retirer la pipette, flamber l'orifice du tube ensemencé, le boucher, homogénéiser son contenu.

     

     

    b) Semence solide portée en milieu liquide

     

    * Flamber le fil à ensemencer, le laisser refroidir pendant quelques secondes, l'extrémité dirigée vers le bas.

    * Déboucher le tube-souche, en flamber l'orifice.

    * Introduire le fil dans le tube et prélever un peu de la culture.

    * Flamber l'orifice du tube et le reboucher.

    * Déboucher un tube de milieu stérile et en flamber l'orifice.

    * Introduire le prélèvement dans le milieu et agiter le fil pour bien incorporer l'inoculum.

    * Flamber l'orifice du tube ensemencé et le reboucher.

     

    c) Semence solide ou liquide portée en milieu solide

     

    Ensemencement en stries

    * Prélever la semence (gouttelette de liquide contenant les bactéries) à l'aide du fil à ensemencer.

    * Introduire le fil jusqu'au fond du tube de gélose inclinée stérile

    * Faire glisser l'anse sur la surface du milieu en décrivant une sinusoïde.

    * Autres opérations comme en (a) et (b).

    * Notez que l'opération a lieu près du bec BUNSEN. c'est un ensemencement de ce type sur boite de Pétri que vous réaliserez en TP.

     

    voir figure ci-dessous (ensemencement sur gélose en tube).

     

    Ensemencement en piqûre

    * Prélever la semence à l'aide d'un fil droit

    * Enfoncer le fil selon l'axe du tube d'un mouvement net au centre et jusqu'au fond du culot de gélose.

    * Autres opérations comme en (a) et (b).

    Ensemencement à la pipette des milieux solides en boites de Pétri

    Schéma général comme en (a)

     

    Petit film sur les tranferts en milieu stérile

     

     

    D - Isolement d'une souche bactérienne , l'ensemencement en quadran (cf schéma ci-contre)

     

     

    Lorsqu'un milieu à ensemencer contient de nombreuses bactéries il est intéressant d'isoler chaque souche bactérienne.

    On peut alors procéder de la manière suivante :

    Stérilement on prélève un peu du milieu contenant les bactéries à isoler puis on les repique dans une boite de Pétri contenant de la gélose nutritive par la méthode des stries de la manière suivante :

     

    Ensemencement en quadran

     

     

    Après un temps de développement à l'étuve à basse température (37° par exemple pendant 24H).

    En 3 et 4 poussent des colonies isolées d'aspects différents.

    Chaque colonie s'est développée à partir d'une bactérie. c'est un clone bactérien. On peut repiquer ensuite chaque clone sur des milieux stériles. On a ainsi obtenu des souches bactériennes pures que l'on peut déterminer et étudier.

     

     

     

    Film sur l'isolement d'une souche bactérienne

     

     

     

    E - La technique des membranes filtrantes

     

    c'est une technique de base en bactériologie de l'eau (cf TP bactériologie)

    Son but est de récupérer sur une membrane filtrante stérile dont le diamètre des pores est inférieur au micron (0,45 microns) les bactéries contenues dans un volume d'eau connu (en principe 100 ml)Nous utiliserons cette technique (Voir TP 1ère année).

     

     

    Tous les déchets microbiens doivent être stérilisés en fin de manipulation (protection de l'environnement et des populations). Aucune bactérie manipulée ne doit sortir vivante d'un laboratoire de bactériologie (stérilisation des déchets à l'autoclave).

      

     

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